流式細胞術精液檢測分析試劑盒——多參數評估精子質量

 

精子質量檢測是診斷男性不育的重要手段,精液的常規分析費時費力,檢測指標單一,只能反映精子的形態特征和有限的功能,無法準確且全面的反映精子質量。

 

流式細胞術(flow cytometry,FCM)是在細胞分子水平上通過單克隆抗體對單個細胞或其他生物粒子進行多參數、快速的定量分析。將FCM用于精液檢查,可把定性的描述過渡到定量的研究,并可進行數據統計,大大提高了實驗結果的科學性,而且可對精液進行高通量、多參數分析,能極大的拓展精子學這個生殖方面的子領域。

 

流式細胞術

 

流式細胞術研究專家EXBIO可提供流式細胞術精液檢測分析試劑盒,從精液的多參數角度評估精子的質量:

 

貨號 ED7079
規格 25 tests
名稱 SpermFlowEx Kit,基于流式細胞術精液檢測分析試劑盒
說明 基于流式細胞儀分析人精液中的以下參數:
精子計數;
白細胞計數;
精子存活率;
精子頂體完整性;
精子中頂端體蛋白;
(應根據WHO的建議,使用光學顯微鏡檢查精子活力和形態)
組分 1.?Intra-acrosomal protein FITC, 0.5 ml(貨號:ED7079-1)
2.?CD45 PE-Cy5, 0.25 ml(貨號:ED7079-2)
3.?Fluorescent Count Standard, 2.0 ml(貨號:ED7079-3)
4.?Propidium Iodide, 0.25 ml(貨號:ED7079-4)
5.?Permeabilizing Solution, 25 ml(貨號:ED7079-5)
說明書 下載
產品圖 SpermFlowEx Kit

 

基于該試劑盒,各指標參數的處理與分析如下:

 

(一)精液中精子及白細胞計數

 

白細胞是精液中常見的一種細胞。白細胞可通過吞噬作用、產生活性氧,分泌一些細胞因子等途徑誘導細胞凋亡,導致精子數量減少。研究發現,白細胞計數增高與精子參數(包括密度)的降低存在明顯相關性。FCM檢測是根據白細胞所表達的共同抗原,用結合熒光染料的單克隆抗體CD45標記白細胞進行檢測,相比于直接鏡檢、過氧化物酶染色等其他檢測手段,FCM可準確區分白細胞與生精細胞,操作簡便,結果可靠,且可進一步區分白細胞各亞群。

 

操作步驟:

  1. 吸取50ul稀釋好的精液至試管中
  2. 加10ul CD45 PE-Cy5抗體溶液
  3. 混合樣品,在室溫下孵育20分鐘
  4. 加50ul熒光計數標準液(首先,將標準液混合均勻,加幾滴到干凈的微管中,然后用移液器從微管中吸取精準體積的標準液加到精子樣本管)
  5. 加5ml PBS,混合后上流式細胞儀

 

精液中精子計數 精液中白細胞計數
1.精液中精子計數 2.精液中白細胞計數
將測量數據可視化為點圖,其中FITC熒光強度在X軸上,前向散射(FSC)在Y軸上。 如圖所示設置門:門A:所有細胞,門B:精子,門C:熒光計數標準品(熒光微珠) 將門A可視化為點圖,其中X軸表示PE-Cy™5染料的熒光強度,Y軸表示側向散射(SSC)。與精子相反,白細胞是CD45陽性。 使用門D區分白細胞。

使用以下公式進行精子和白細胞的計數:
精子和白細胞的計數

S:精液中的精子數

L:精液中的白細胞數

Gate B: B門中的event count值

Gate C: C門中的event count值

Gate D: D門中的event count值

 

(二)精子存活率

PI (碘化丙啶, Propidium Iodide)是一種可對DNA染色的細胞核染色試劑,是一種溴化乙啶的類似物,在嵌入雙鏈DNA后釋放紅色熒光。盡管PI不能通過活細胞膜,但卻能穿過破損的細胞膜而對核染色,只有沒有活力的精子才會被碘化丙啶溶液染色。因此用FCM結合DNA熒光染料PI,可以反映出精子的存活率。
操作步驟:

  1. 吸取50ul稀釋好的精液至試管中
  2. 加10ul PI溶液
  3. 混合均勻,在室溫下孵育20分鐘
  4. 加0.5mlPBS,混合后上流式細胞儀

結果

精子細胞設門 精子存活率
3.精子細胞設門 4.精子存活率

 

將測量數據可視化為前向散射(FSC)與側向散射(SSC)點圖。 如圖3所示,在精子細胞周圍設門。然后在直方圖中可視化精子細胞(圖4),其中X軸表示PE-Cy5或PerCP通道中碘化丙啶的熒光強度。使用適當的門分離陽性和陰性精子細胞。 陰性群體代表有活力的精子,而PI陽性群體則代表無活力的精子。 精子的生存率由所有精子細胞中有活力的精子的百分比表示。

 

(三)頂體完整性和頂端體蛋白的存在

 

在受精過程中,哺乳動物剛射出的精子在體內要經過獲能和頂體反應,才能穿入卵細胞并與其融合,完成受精。因此檢測精子的頂體狀態,有助于反映精子的受精能力。精子頂端體蛋白(intra-acrosomal protein),是一種在成熟精子的頂體膜上特異性表達的蛋白,該蛋白在幾乎所有人類精子樣本中都能被檢測到,且表達量穩定。利用標記了FITC熒光素的頂端體蛋白抗體,特異性地標記在頂體膜上,其熒光強度可反映頂體大小,因此通過測定熒光強度可間接反映頂體結構的完整性。

 

操作步驟-頂體的完整性

  1. 吸取50ul稀釋好的精液至試管中
  2. 加1 ml PBS,混合后,150 g離心5分鐘,去上清
  3. 再洗一次(重復步驟2)
  4. 向沉淀中加10ul Intra-acrosomal protein ?FITC抗體
  5. 混合均勻,在室溫下孵育20分鐘
  6. 加0.5mlPBS,混合后上流式細胞儀

 

操作步驟-是否存在Intra-acrosomal protein(需透化

  1. 吸取50ul稀釋好的精液至試管中
  2. 加1 ml滲透液
  3. 混合均勻,室溫下孵育15分鐘
  4. 150 g離心5分鐘,去上清液
  5. 向沉淀物中加入1 ml PBS,混合均勻,以150 g離心5分鐘
  6. 再洗一次(重復步驟5)
  7. 加入10 ul Intra-acrosomal protein ?FITC抗體
  8. 充分混勻,室溫下孵育20分鐘
  9. 加5mlPBS,混合后上流式細胞儀

 

結果

非透化,非病理性精子 透化的非病理性精子 非透化病理性精子
5.非透化,非病理性精子 6.透化的非病理性精子 7.非透化病理性精子

 

可視化抗體(頂端體蛋白FITC)對可滲透和未滲透樣品染色的前向散射(FSC)與側向散射(SSC)點圖,并在精子周圍設門,如圖3所示。然后在直方圖中可視化精子事件(見圖5-7),其中X軸表示熒光強度 在FITC熒光檢測器中。 使用適當的門將陽性和陰性精子分開。 圖5顯示了陽性精子含量低(<30%)的未透化非病理性精子事件。 陰性代表具有完整頂體的精子,陽性代表具有受損的頂體的精子。圖6顯示了滲透性非病理性精子,其中陽性精子占主導地位。 陽性精子表明存在頂端體蛋白。圖7顯示了未滲透的病理性精子,其中頂體受損的陽性精子的含量高(> 30%)。

 

EXBIO是捷克一家著名的生物試劑公司,專注于流式細胞術配套試劑的開發。自1990年成立以來,EXBIO公司研發和制造的抗體分銷全球。目前,EXBIO可提供超過4000種質優、價廉的研究和臨床應用抗體,涵蓋了血液學,免疫學,癌癥,干細胞和細胞生物學等領域,如:CD分子、細胞粘附分子、細胞骨架、凋亡、細胞信號傳導、腫瘤標志物、人血型、HLA、生殖等研究用抗體,涉及熒光染料如FITC、PE、PE-Cy5、PE-Cy7、APC、PerCP、PerCP-Cy5.5、Pacific Blue、Pacific Orange、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 700、Biotin等多達13種,滿足客戶各類實驗需求。

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