Comet Assay Kits 彗星分析試劑盒說明書(以STA-350,3孔板為例)

 

艾美捷科技,Cell Biolabs中國區總代理 ??

 

產品名稱 貨號 規格 說明
Comet Assay Kits, 3-Well?(3孔玻片)
(最常用)
STA-350 15 assays(5片) 彗星分析試劑盒(3孔玻片)
STA-351 75 assays(25片)
STA-351-5 5*75 assays(5*25片)
Comet Assay Kits, 96-Well(96孔玻片)
(高通量篩選)
STA-355 96?assays(1片) 彗星分析試劑盒(96孔玻片)
STA-355-5 5*96?assays(5片)

彗星分析試劑盒

*為方便客戶使用試劑盒,艾美捷科技善意將其翻譯成中文操作手冊,請以試劑盒中配套的英文版為準。因編者翻譯水平有限,對于由本說明書中不當翻譯所造成的損失,概不負責,如有錯誤,歡迎指正!

本說明書對應英文鏈接:https://www.cellbiolabs.com/sites/default/files/STA-350-comet-assay-kit.pdf

 

實驗開始前,建議先通讀說明書(請以試劑盒中配套的英文版為準):

 

介紹:由于環境因素和細胞內正常的新陳代謝過程,DNA損傷每天以每個細胞1000到100萬個分子損傷的速度發生。雖然這只占人類基因組約60億個堿基(30億個堿基對)的一小部分,但關鍵基因的未修復損傷可能會阻礙細胞發揮其功能的能力,并顯著增加癌癥的可能性。彗星實驗(Comet assay)也被稱為單細胞凝膠電泳實驗(Single cell gel electrophoresis,SCGE),是一種超靈敏的單細胞水平上檢測DNA損傷的技術。在電泳場下,損傷的細胞DNA(包含碎片和鏈斷裂)從完整的DNA中分離出來,在顯微鏡下形成典型的“彗星尾巴”形狀。DNA損傷的程度通常是通過測量彗星尾巴來目測的,也可以使用圖像分析軟件來測量各種參數。

 

OxiSelect™ Comet Assay是一種快速、靈敏的,用于測量細胞DNA損傷的試劑盒。每個試劑盒提供足夠的試劑,最多可進行15次檢測。

 

OxiSelect™ Comet Assay實驗原理:Cell Biolabs 的 OxiSelect™ Comet Assay 是一種單細胞凝膠電泳法 (SCGE),用于簡單評估細胞 DNA 損傷。首先,將單個細胞與低熔點瓊脂混合后,再應用到OxiSelect™ Comet特制玻片上。然后,用裂解緩沖液和堿性溶液處理這些嵌入的細胞,使DNA松弛并變性。最后,在電泳槽中對進行電泳,以分離完整的DNA和受損的片段。電泳后,樣品被干燥,用DNA染料染色,并通過外顯熒光顯微鏡可視化。在這些條件下,受損的DNA(包含裂解和鏈斷裂)將比完整的DNA遷移更多,并產生 "彗星尾 "形狀(見圖1)。

 

彗星實驗原理與流程示意圖

圖1,彗星實驗原理與流程示意圖

 

試劑盒組分(以STA-350,3孔板為例):

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組分 組分編碼 規格
OxiSelect™ 3-Well Comet Slides
特制3孔玻片(表面處理)
STA-352 5片(每片上有3孔)
OxiSelect™ Comet Agarose
彗星實驗專用低熔點瓊脂糖膠
235002 15ml(1瓶,無菌)
Vista Green DNA Dye, 10000X
綠色熒光DNA染料,10000X
235003 5ul(1支)
EDTA Solution, 500 mM
EDTA溶液,500mM
235004 50ml(1瓶)
10X Lysis Solution
10X 裂解液
235005 20ml(1瓶)

 

客戶自備材料:

  1. 氯化鈉粉末
  2. NaOH顆粒
  3. 10 N NaOH,用于調整pH值 (10 N NaOH = 10 M NaOH =10 mol/L NaOH)
  4. DMSO(可選)
  5. 70%乙醇
  6. TE緩沖液(10mM Tris,pH 7.5,1mM EDTA)。
  7. PBS(不含Mg2+和Ca2+)。
  8. EDTA(二鈉鹽)
  9. DI H2O(去離子水)
  10. 37oC和沸水浴
  11. 水平電泳槽
  12. 可調節的單通道微量移液器,帶一次性吸頭。
  13. 帶FITC過濾器的外顯熒光顯微鏡

 

保存條件:收到試劑盒后,將綠色熒光DNA染料,10000X存放在-20oC。 所有其他試劑盒組件在室溫下儲存。

 

《實驗步驟》以STA-350,3孔板為例

 

為方便客戶使用試劑盒,艾美捷科技善意將其翻譯成中文操作手冊,請以試劑盒中配套的英文版為準。因編者翻譯水平有限,對于由本說明書中不當翻譯所造成的損失,概不負責,如有錯誤,歡迎指正!本說明書對應英文鏈接:https://www.cellbiolabs.com/sites/default/files/STA-350-comet-assay-kit.pdf

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一、試劑準備:

 

1.OxiSelect™ CometAgarose將Comet Agarose瓶放在90-95oC水浴中加熱20分鐘,或者直到瓊脂膠液化。將瓶子轉移到37℃的水浴中20分鐘,并保持直到使用。

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2.1X Vista Green DNA Dye工作液:使用TE緩沖液(10 mM Tris, pH 7.5, 1 mM EDTA)稀釋原10000X的Vista Green DNA Dye母液,按照1:10000的比例,稀釋成1X的Vista Green DNA Dye工作液。1X工作液可在4℃避光條件下保存3周。

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3.Lysis Buffer: 準備100ml的1X 裂解緩沖液

 

NaCl 14.6 g
EDTA Solution (試劑盒提供) 20ml
10X Lysis Solution (試劑盒提供) 10ml
DMSO 10ml(樣品中含血紅素,則加入)
DI H2O(去離子水) 調整體積到90ml
充分混合以溶解NaCl。緩慢加入10 M的NaOH來調節Lysis Buffer的pH值到10.0,最后再使用去離子水調整體積,定容到100ml。冷藏裂解液到4℃,直到使用。
* Note: 緩沖液在室溫下會看起來渾濁,但在4oC時會變清。pH也會保持在約10.0。

* 血紅素在4℃成膠狀,用DMSO溶解的血紅素。DMSO的添加是任選的,僅對含有血紅素的樣品(例如血細胞或組織樣品)是必需的。加入DMSO對實驗結果沒有影響。

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4.Alkaline Solution準備100ml的堿性溶液

 

NaOH 1.2g
EDTA Solution (試劑盒提供) 0.2ml
DI H2O(去離子水) 調整體積到100ml
充分混合以溶解NaOH。冷藏堿性溶液到4℃,直到使用。

 

5.Electrophoresis Running Solution: 準備1L電泳緩沖液,需求選擇電泳模式(二選一)

電泳模式 檢測類型 電泳時間 說明
TBE電泳(中性電泳) 檢測單鏈雙鏈DNA的斷裂 推薦
10-15 mins
分析細胞凋亡的首選方法,可使用尾巴長度而非尾矩進行數據分析。
堿性電泳 檢測單鏈雙鏈DNA的斷裂,AP位點損傷在內的所有DNA 損傷 推薦
15-30mins
靈敏度最高!

* 實驗過程中的各類緩沖液都需要4℃預冷。

 

5.1 TBE Electrophoresis Solution (中性)

 

Tris Base 10.8g
Boric Acid 5.5g
EDTA(二鈉鹽) 0.93g
DI H2O(去離子水) 調整體積到1L
充分混合以溶解固體顆粒。冷藏TBE電泳緩沖液到4℃,直到使用。

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或者5.2 Alkaline Electrophoresis Solution (300 mM NaOH, pH >13, 1 mM EDTA)(堿性)

 

NaOH 12g
EDTA Solution (試劑盒提供) 2ml
DI H2O(去離子水) 調整體積到1L
充分混合以溶解NaOH。冷藏堿性電泳緩沖液到4℃,直到使用。

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特殊說明:為避免紫外線對細胞樣品造成額外損害,請在弱光條件下進行實驗。

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二、準備樣品和玻片:

 

1.準備裂解緩沖液、堿性溶液和電泳緩沖液(見試劑準備),然后再進行實驗。將所有溶液徹底冷卻至4oC

 

2.將OxiSelect™ Comet Agarose放在90-95oC水浴中加熱20分鐘,或者直到瓊脂膠液化。將瓶子轉移到37℃的水浴中20分鐘進行冷卻,并保持直到使用。

 

3.在OxiSelect™ Comet玻片上,每孔加入75 ul 37℃的Comet Agarose,形成基層膠用移液器將膠溶液涂抹在孔上,確保完全覆蓋和平鋪。將載玻片轉移到4oC下水平放置15分鐘,使其固化。

 

4.按照如下方式準備細胞樣品,與對照細胞:

懸浮細胞:以700×g離心2mins,棄上清,用冰冷的PBS(無Mg2+和Ca2+)洗滌細胞一次,離心,棄上清。最后,用預冷4℃的PBS(無Mg2 +和Ca 2 +)重懸細胞到1×105個細胞/ml 。

貼壁細胞:輕輕地從細胞培養瓶/培養皿中取出細胞,用橡膠細胞刮處理。將細胞懸浮液轉移到錐形管(EP)中,并在700×g離心2mins,棄上清。用冰冷的PBS(不含Mg2+和Ca2+)洗滌細胞一次,離心,并丟棄上清液。最后,用預冷4℃的PBS(無Mg2 +和Ca 2 +)重懸細胞到1×105個細胞/ml 。

組織樣品:使用解剖剪刀,切碎一小塊組織到1-2ml冰冷的含20mM EDTA的PBS緩沖液(無Mg2 +和Ca 2 +)。組織/細胞懸浮液放置5分鐘,然后將上清液轉移到離心管中,避免轉移碎片。700×g離心2mins,丟棄上清液。最后,用預冷4℃的PBS(無Mg2 +和Ca 2 +)重懸細胞到1×105個細胞/ml 。

* 推薦陽性對照:使用20 uM Etoposide(依托泊苷)處理4小時。

 

5.將細胞懸液Comet Agarose(步驟2)以1:10的比例(v/v),用移液槍混合均勻,并立即轉移75ul 到每個孔中的原基層膠上方(步驟3)。確保完全覆蓋平鋪孔板,非常輕柔和小心地用移液管尖傳播的懸浮液,而不干擾基層膠

Note:?對于多個樣品的處理,將細胞與Comet Agarose混合液保持在37℃,避免凝膠化。準備好樣品后,重新混勻,依次取出75ul加入到玻片孔中。

 

 

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  • 發表文獻

 

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